【Application Note】CarboMAX™ – 在提高的温度下增强的肽偶联

01  概述 Summary

CarboMAX 是一种创新的专利偶联技术,专为高温下的肽链合成而设计。该技术相较于现行的碳二亚胺方法,提供了更快的反应激活速度,和减少相应的外消旋化,从而显著提升了合成效率。此外,CarboMAX 在高温条件下增强了对酸敏感连接物的稳定性,特别对于磷酸肽、糖肽的合成,以及在超酸敏感链接剂上进行肽链合成时,这一特性尤其有利。

02  引言 Introduction

近期研究表明,在 90°C 的条件下,利用高效固相肽合成过程(HE-SPPS)进行的原位碳二亚胺激活可以实现快速且高效的肽偶联。HE-SPPS 避免了使用基于季铵盐的方法(例如 HCTU 和 HATU)时所需的大量强碱,从而减少了显著的外消旋化问题(特别是对于半胱氨酸),以及由于d-内酰胺形成而导致的精氨酸缺失。CarboMAX 偶联方法通过对现有碳二亚胺方法的两个主要改进,进一步提升了合成效果:

 

(i) 提升粗制品纯度与减少外消旋化:

CarboMAX 通过提高相对于氨基酸的碳二亚胺用量(2当量),加速了必要的O-酰基异脲激活中间体的形成,这一过程在碳二亚胺激活中通常较为缓慢。O-酰基异脲形成的速率增加,使得偶联步骤早期即可获得更多的激活氨基酸。因此,实现了更快的偶联速度,并相应地降低了外消旋化的发生。在众多实例中,CarboMAX 的应用显著提升了粗制品的纯度。

 

(ii) 避免酸敏感官能团/接头的非期望裂解:

与碳二亚胺化学反应配合使用的激活剂(如Oxyma Pure)具有酸性,可能在高温下过早地移除酸敏感基团。CarboMAX 方法通过使用少量的碱(相对于激活氨基酸 0.4 当量的 DIEA)来稳定这些酸敏感连接体。这些碱的用量足够低,不会干扰激活过程,同时保持外消旋化降至最低。

03 材料与方法 Materials and Methods

试剂

所有标准的 Fmoc 氨基酸均购自 CEM 公司(位于北卡罗来纳州的马修斯),包含以下侧链保护基团:Arg(Pbf),Asn(Trt),Asp(OMpe),Cys(Trt),Gln(Trt),Glu(OtBu),His(Trt),Lys(Boc),Ser(tBu),Thr(tBu),Trp(Boc)和Tyr(tBu)。磷酸化氨基酸 Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)-OH,Oxyma Pure 以及 Rink Amide ProTideTM LL 树脂也购自 CEM 公司(位于北卡罗来纳州的马修斯)。Fmoc-Thr(β-D-GlcNAc(Ac)3)-OH和Fmoc-Lys(palmitoyl-Glu-OtBu)-OH 购自 Bachem(瑞士)。N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC),N,N-二异丙基乙胺(DIEA),哌啶,三氟乙酸(TFA),3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇(DODT),三异丙基硅烷(TIS)和乙酸购自 Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。二氯甲烷(DCM),N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醚(Et2O)购自VWR(宾夕法尼亚州西切斯特)。HPLC级水(H2O)和HPLC级乙腈(MeCN)购自Fisher Scientific(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。

 

肽合成

肽的制备采用 0.05 或 0.1 毫摩尔规模,使用 CEM Liberty Blue™ 自动化微波肽合成仪,在 0.18 毫摩尔/克的 Rink Amide ProTide LL 树脂(CEM零件号R002)上进行,除非另有说明。去保护反应使用含有20% 哌啶的 DMF 进行。偶联反应使用 5 当量的氨基酸,以 Fmoc-AA-OH/DIC/Oxyma Pure 在 DMF 中进行。切割步骤使用 CEM Razor 高通量肽切割系统,在升高的温度下用 TFA/H2O/TIS/DODT 进行 30 分钟。切割后,肽在冷乙醚中沉淀并过夜冻干。

 

肽分析

肽的分析在配备有 PDA 检测器的 Waters Acquity UPLC 系统上进行,该系统装配了 Acquity UPLC BEH C8 柱(1.7 mm 和 2.1 x 100 mm)。UPLC 系统连接到 Waters 3100 Single Quad MS 以进行结构鉴定。峰分析通过 Waters MassLynx 软件实现。分离采用含有0.05% TFA 的 (i) H2O 和 (ii) MeCN 的梯度洗脱进行。

04 结果 Results

通过采用 CarboMAX 策略(即相对于氨基酸使用 2 当量的 DIC),相较于传统的 1 当量使用,显著提升了肽的纯度。

 

这一改进在 8 种知名肽的合成过程中得到了验证,这些肽分别采用了标准碳二亚胺化学方法和 CarboMAX 策略进行合成(见表1;图1至6)。关键的是,在使用过量碳二亚胺的过程中,并未发现不良封端现象。

 

表1. 通过应用 CarboMAX 偶联方法改善了肽的纯度

粗纯度

(标准)

粗纯度 (CarboMAX)

Thymosin

63%

75%

GRP

62%

74%

Bivalirudin

80%

82%

1-34PTH

67%

85%

35-55MOG

77%

91%

Magainin 1

71%

79%

Dynorphin A

74%

82%

Liraglutide*

74%

88%

*用~0.32 mmol/g Fmoc-Gly-Wang PS树脂合成

通过优化O-酰基异脲的形成过程,CarboMAX 技术能够迅速供应更高浓度的活性氨基酸。这一优势对于缩短敏感酯类物质在后续酰化反应前的存活时间至关重要。为了证实此效果,研究人员采用了水解、继之衍生化以及气相色谱(由 C.A.T. GmbH 执行)等手段,对 Liraglutide 序列中各氨基酸的差向异构水平进行了深入分析。表 2 的数据明显显示,在使用 CarboMAX 的过程中观察到的差向异构现象有减少的趋势,从而佐证了加速O-酰基异脲生成的理论。因此,相较于以往描述的任何高温偶联方法,CarboMAX 偶联技术凭借其提升的偶联效率和降低的差向异构率,实现了更卓越的粗制品纯度。

 

表2. 利拉鲁肽的差向异构化水平

%-D 差向异构体

2 分钟 90 °C

 标准

2 min-90 °C 

CarboMAX

D-Ala

0.33

0.25

D-Arg

0.29

0.20

D-Asp

0.23

0.31

D-Glu

0.39

0.30

D-Ile

L-allo Ile

D-allo Ile

<0.10

<0.10

<0.10

<0.10

<0.10

<0.10

D-Leu

0.17

0.13

D-Lys

<0.10

0.10

D-Phe

0.20

0.16

D-Ser

0.16

0.12

D-Thr

L-allo Thr

D-allo Thr

<0.10

<0.10

<0.10

<0.10

<0.10

<0.10

D-Trp

0.24

<0.10

D-Tyr

0.12

0.11

D-Tyr

<0.10

<0.10

 

CarboMAX 策略的一个可选优化是在氨基酸反应中采用 0.4 当量的碱。这一调整确保了在整个激活和偶联过程中,DIEA(N,N-二异丙基乙胺)以催化量存在,有效地稳固了酸敏感键合(详见表 3)。该优化最初通过应用超酸敏感树脂链接剂进行了验证。在肽合成领域,运用诸如2-Cl-三苯甲基、三苯甲基(Trt)以及 Cl-TCP 这类超酸敏感链接剂至关重要,它们促进了受保护的肽段的缩合,防止了二酮哌嗪生成,规避了在树脂装载时的DMAP使用,并显著减少了 C 端半胱氨酸残基发生β消去的风险。

 

在 90°C 条件下,采用 DIC/Oxyma Pure 进行的标准碳二亚胺偶联反应仅进行了 2 分钟,这导致了在三苯甲基树脂连接剂上合成 ACP 肽的产率不尽人意。不过,当反应中加入了 0.1 当量的 DIEA 并在同样的高温下实施 CarboMAX 偶联策略时,不仅保护了三苯甲基连接剂的键稳定性,还成功地将产率显著提升,从原先的 38% 跃升至 96%。这一显著的提升彰显了 CarboMAX 偶联方法在提高肽合成效率方面的优越性。

 

表3. 使用高酸敏感型 Fmoc-Gly-NovaSyn TGT 树脂合成ACP

偶联温度(°C)

偶联时间(min)

激活

DIEA(当量)

粗品纯度(%)

粗品收率(%)

90

2

DIC/Oxyma Pure

0

90

38

90

2

DIC/Oxyma Pure

0.1

95

38

65-74ACP: VQAAIDYING

 

在高温条件下,涉及磷酸氨基酸衍生物的合成反应面临着由β-消除引起的磷酰基团丢失的风险,这种风险在去保护和酸性切割过程中尤为显著。此外,一旦磷酸氨基酸被引入到序列中,它所产生的显著空间位阻会使得后续残基的偶联变得异常困难。采用 CarboMAX 偶联方法并配合 0.4 当量的 DIEA,研究成功合成了以 3 个磷酸氨基酸残基为主的目标磷酸肽,如图 7a 所展示的成果。与此形成鲜明对比的是,未添加 DIEA 的合成实验未能检测到目标肽的存在(图 7b)。

 

TpTGNGKPVECpSQPESSFKMpSFKR

图7a. 使用 UPLC-MS 分析粗磷酸肽 0.4 等效 DIEA (CarboMAX)

图7b. 粗磷酸肽的 UPLC-MS 分析(标准品)

 

此外,O-连接的糖基氨基酸含有可能在高温碳二亚胺偶联过程中断裂的敏感键。通过采用 CarboMAX 偶联技术并添加 0.4 当量的 DIEA,实现了 MUC-1 糖肽的合成,粗品纯度高达 72%,如图 8 所示。值得一提的是,CarboMAX 方法仅需要使用 2 当量的糖基氨基酸过量,这在考虑到糖基化氨基酸昂贵成本的情况下,显著降低了材料费用,经济效益显著。

 

PAHGVT[β-D-GlcNAc(Ac)3]SAPDTRPAPGSTAP

图8. 使用 UPLC-MS 分析粗 MUC-1 糖肽 0.4 等效 DIEA (CarboMAX)

05 结论 Conclusion

CarboMAX 方法通过微波辅助的固相肽合成技术实现了更快的偶联反应和较低的差向异构化。对于昂贵或难以合成的氨基酸残基,仅需使用 2 当量即可有效进行偶联。此外,可选地加入催化量的 DIEA(0.4 当量),有助于在高温条件下预防酸敏感键的不必要断裂,从而保护了肽链的完整性。

引用 References

(1) J. Collins, K. Porter, S. Singh and G. Vanier, “High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS),” Org. Lett., vol. 16, pp. 940-943, 2014.

(2) Patent Pending: US15686719; EP17188963.7

(3) Patent Pending: US20160176918; EP3037430;JP2016138090; CN105713066; AU2017204172