【ISCO 制备色谱仪】快速色谱法在简单碳水化合物纯化中的应用

01 摘要

 

碳水化合物化合物可利用 RediSep Gold Amine 色谱柱结合蒸发光散射检测(ELSD)进行简便的纯化。该色谱柱采用亲水相互作用液相色谱(HILIC)梯度洗脱法,以乙腈或丙酮与水的梯度进行操作。将待纯化的样品溶解于 DMSO 中,不仅允许大量样品加载,同时还能保持良好的分辨率

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02 背景    
   

碳水化合物通常采用氨基柱进行分析,该方法具有良好的分辨率。这种分析方法一般使用乙腈和水作为流动相,样品通常溶解在水中。由于样品注射量较小,样品有机会吸附在固定相上。在制备色谱中,相对于色谱柱尺寸而言,样品负载和注射体积要大得多,因此将样品溶于水中注射会让样品引无法吸附在柱子上,然后在空隙处洗脱。干法加载样品到固体装载小柱上(由固体装载小柱实施干法加载)常用于快速色谱,但用户需要自己用氨基介质填充他们的小柱。样品仍然溶解在水中进行加载,这需要很长时间才能在运行样品前蒸发。

 

二甲基亚砜(DMSO)常用于反相色谱的样品溶解,因为它能溶解大多数化合物。DMSO 能够溶解碳水化合物,但在 HILIC 中是一种弱溶剂,因此它允许样品吸附在柱子上。在使用氨基柱时,DMSO 洗脱早期被洗脱;然而,在采用非氨基介质的其他 HILIC 运行中,它可能在梯度洗脱的后期才被洗脱。    
   

03 结果与讨论    
   

虽然亲水相互作用液相色谱(HILIC)属于正相色谱,但它使用的溶剂通常适用于反相色谱,因此需要根据表 1 中的设置调整蒸发光散射检测器(ELSD)的参数,以保持基线稳定的同时维持灵敏度。    
   

表1. 纯化碳水化合物的蒸发光散射检测器(ELSD)设置。    

ELSD控制                                    

设置值                                    

Spray Chamber

20℃

Drift Tube

60℃

Gain

1

Sensitivity

High

 

 

样品均溶解于 DMSO 中。如有必要,将样品在热水浴中加热以促进溶解。使用 PeakTrak Flash Focus 梯度生成器在系统上开发方法。运行了一个亻贞查梯度以验证样品能够被洗脱,并证明化合物之间有足够的分辨率以实现成功的纯化。化合物的滞留时间用于计算聚焦梯度的溶剂比例。 本文中所有运行 均使用 RediSep Gold® 氨基柱。运行完成后,用2-丙醇洗涤并储存柱子,2-丙醇与有机溶剂混溶,可实现 快速纯化低极性化合物。

 

第一个实例使用了核糖和葡萄糖。亻贞查梯度和聚焦梯度都使用乙腈作为弱溶剂。亻贞查运行只用了少量几毫克,并且为了提高这个小样品负载的灵敏度,ELSD 增益被调高到 3。第二个洗脱峰用于聚焦梯度;计算梯度后,ELSD 增益被重置为 1 以保持 ELSD 响应在量程内。本案例使用50克的RediSep Gold氨基管柱分离100毫克混和物。    
   

果糖和蔗糖通常一起出现在样品中。图 2 展示了从杂质中纯化果糖的过程。该混合物以与核糖-葡萄糖样品类似的方式运行,但改採行梯度聚焦于葡萄糖。在约 1.8 柱体积(CV)出现的峰是用于溶解样品的 DMSO    
   

   

图1. 核糖和葡萄糖在 5.5 克 RediSep Gold Amine 柱上运行亻贞查方法(上图),并聚焦到 50 克 RediSep Gold 胺柱上。样品总负载量为核糖和葡萄糖各 50 毫克。聚焦梯度中约 1.8 柱体积处的小峰是 DMSO。    

   

图2. 使用 RediSep Gold Amine 柱和乙腈/水梯度从蔗糖中纯化不纯的果糖。


   

04 丙酮作为弱溶剂    
   

丙酮也是 HILIC 的弱溶剂,可以替代乙腈使用。尽管醇类可以用于 HILIC,但这些溶剂对于在胺柱上纯化碳水化合物来说太强了。使用丙酮纯化了一个果糖和葡萄糖的样品。    
   

该混合物的纯化方式与之前的例子相似,除了运行亻贞查梯度时使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold Amine 柱,因为 PeakTrak 允许使用任何尺寸的 Teledyne ISCO 柱进行亻贞查运行。聚焦梯度使用了一根 50 克的 RediSep Gold Amine 柱,但计算出的梯度需要较低的水浓度来纯化葡萄糖,这表明对于这些化合物,丙酮是比乙腈更强的溶剂。    
   

   

图3. 使用丙酮/水梯度纯化的果糖和蔗糖。亻贞查运行使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold 胺柱。    


   

05 结论    

   

 

使用PeakTrak Flash Focus Gradient Generator(梯度生成器)搭派上Teledyne ISCO的所有色谱管住,这可以帮助您迅速找出蕞适合洗脱条件,并提升纯化量能。