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高通量组织研磨仪提取动物组织样品中的RNA/cDNA和基因组DNA

高通量组织研磨仪提取动物组织样品中的RNA/cDNA和基因组DNA

2019/05/28 16:41
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1、样品采集、制备和组织研磨

    采集新鲜动物组织样本,修剪至约50-100mg湿重,在液氮中快速冷冻,并保存在-80℃低温冰箱中。样品来自于人、狗、猫、老鼠、牛、马,还有鱼和蛤(见表1所示)。在提取DNA或RNA之前,将这些冷冻后的组织,放入深孔板中,并将深孔板放置在干冰上冷冻。每个孔中放入两颗4m钢珠(SPEX货号2150) ,再加入500mL缓冲液(应用生物系统核酸纯化裂解缓冲液)。用深孔板盖板密封,在高通量组织研磨仪上以每分钟1000次的速度研磨2min。4℃环境下培养30min后,用裂解液提取gDNA或总RNA。使用高通量组织研磨仪优化后,再使用6700全自动核酸工作站进行实时PCR,最后提取的RNA或DNA的组织量在10到20mg之间。

 

2、采用Real-Time Taqman PCR技术对提取的RNA/cDNA和基因组DNA进行质量控制

    为评价提取的RNA的质量,采用Invitrogen产品合成互补DNA (cDNA):200 units of SuperScript III, 600 ng of random hexadeoxyribonucleotide (pd(N)6) primer (random hexameter priner), 10 U RnaseOut (Rnase inhibitor), and 1 mM dNTPs in a final volume of 40 L.

    逆转录反应在50℃下进行50min,加入60微升水,加热5min至95℃,在冰上冷却,终止反应。根据内源性对照TaqMan PCR系统从一定数量的组织中获得的CT值判断cDNA的质量。值高于一定阈值的样品表明样品质量受损,总RNA降解,需要重新提取备用样品。为了评估cDNA的质量,我们通常使用的TaqMan PCR系统,目标是物种特异性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)或核糖体基因(如18S rRNA或ITS-2)。

    为了评估提取的基因组DNA的质量,开发了针对单个拷贝基因的物种特异性TaqMan PCR系统,以定量基因组当量和细胞数量。表1概述了用于gDNA质量控制的TaqMan系统。使用针对单个复制基因的TaqMan PCR系统,根据CT值判断一定数量组织的gDNA质量。值高于某一阈值的样本表明DNA已经降解,需要重新提取备用样本。GAPDH TaqMan系统可以用来靶向单拷贝GAPDH伪基因。

    每个Real-Time TaqMan每个引物的PCR反应包含400nM,80nM的TaqMan探针和市场上买到的PCR试剂(TaqMan一般性PCR试剂:Applied Biosystems)包含10mM Tris-HCl (pH值8.3),50 mM KCl,MgCl2 2.5mM,2.5mM三磷酸脱氧核苷酸,0.625 U AmpliTaq Gold DNA polymerase per reaction, 0.25 U AmpErase UNG per reaction and 5μL of the diluted cDNA sample or the gDNA in a final volume of 25 μL.样品置于96孔板中,在自动荧光仪(ABI PRISM 7700序列检测系统,Applied Biosystems)中扩增。扩增条件为50℃时为2 min, 95℃时为10 min, 95℃时为40个15s,60℃时为60 s循环。

 
 

3、结论

    使用SPEX高通量组织研磨仪研磨动物组织,可以快速高通量的完成样品制备,且核酸提取量高、提取的核酸质量好。

 

 
 

SPEX高通量组织研磨仪

超高通量:一次可处理576个样品或16个50mL样品瓶

超高效率:垂直振荡专利技术,1-2min完成困难样品研磨、均质

高均一性:批量处理样品,程序化处理机制,均一性、重复性更好

更人性化:可调角度彩色触摸显示屏,可编辑、调用、存储500种方法

适用性广:程序可调,更多研磨瓶、研磨介质可供选择,完美契合不同样品研磨、混匀需求

安全可靠:双重门锁,研磨过程更安全;设置保密程序,限制查看特定方法

低温研磨:专业Kryo-Tech低温组件及可调循环程序,维持研磨全过程低温,适合温度敏感型样品

 
 
 
 

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