一种无酚/无氯仿组织研磨从热带木本植物中提取核酸的方法，可用于基因表达和测序

木本热带植物中含有大量复杂的有机化合物，这些有机化合物会抑制提取RNA或DNA所需的化学程序，从而不利于后续研究及应用，如RNA测序和基因表达分析。为了克服这个问题，研究人员必须使用CTAB / PVP缓冲液的提取方案，而不能使用市售的DNA / RNA提取试剂盒。但是，这种提取方式耗时长、需使用有毒化学品（例如苯酚和氯仿），并且一次只能处理少量样品。为了克服这些问题，作者开发了一种基于CTAB / PVP的新方法，用于RNA或DNA提取，去掉了传统方法中的苯酚/氯仿步骤。此外，该方法同样适用于96孔深孔板，使用SPEX高通量组织研磨仪，一次研磨6块深孔板，同时处理576个样品，大大加快了处理速度。

作者在文章中验证了，新方法能够从夏威夷果、牛油果和芒果组织中，成功提取RNA（这些组织使用传统方法很难提取到RNA）。而后作者还验证了，该方法提取的RNA成功地合成cDNA，以进行实时定量PCR并生成高质量的RNA-Seq库。该方法经轻微改动后，可用于从不同的热带和亚热带树种中快速提取DNA。

这种方法可以更安全、更快速地从困难样品中提取DNA和RNA，从而为将来在热带树木上的研究提供了便利。

01 背景

分子实验揭示了植物物种的生理遗传结构和功能，使种植者能够在不断变化的环境条件下提高生产力。然而，从植物中提取的RNA或DNA的传统方法中，使用的是草本植物（如拟南芥），但这种方法并不能很好地使用在某些植物种类上。例如，热带树木的组织中含有的多糖和多酚类物质，会阻碍传统方法中核酸的提取。从这些物种中提取RNA或DNA通常依赖于使用苯酚和氯仿，但它们易挥发、毒性强，如果研究人员的经常使用，危害很大，是不适合作为常规方法的。因此，我们试图通过摸索更安全、更快速的方法，来改善热带树木中RNA或DNA的提取实验。

在本项研究中，我们开发并测试了一种从热带/亚热带木本植物的各部分组织中提取DNA和总RNA（包括小RNA）的新方法，包括牛油果（Persea americana L.），夏威夷果（Macadamia integrifolia L.）和芒果（Mangifera indica L.）。我们的方法不需要苯酚或氯仿，可在不到1天的时间内，在96孔板中提取96个样品。可以对所得的RNA进行测序，并用于产生高质量的RNA-Seq读数。DNA提取方法还可以用于咖啡树（Coffea arabica L.）和桉树（Eucalyptus grandis L.）。该方法将有助于对热带树木进行新颖的分子研究，这在以前，对其进行大规模遗传调查和实验非常困难。

02 材料和方法

植物材料和组织研磨

从田间种植的牛油果树中收集了多种组织样本。哈斯·芒果品种：1243，夏威夷果品种：751，澳大利亚昆士兰州的咖啡和桉树。所有树木都已成熟（8至15岁）。从成熟叶片中提取DNA，而在茎，叶，根，花和腋芽组织上进行RNA提取。拟南芥品种：Columbia-0，豌豆品种：Torsdag，用于评估该方法对草本植物的有效性。

将新鲜样品在液氮或干冰中速冻，并在研磨成粉末（均质）之前，在-80°C下储存。冷冻的样品进行研磨，使用自动组织研磨仪（Geno /Grinder®2010，SPEX高通量组织研磨仪）。将叶、芽、花和根样品在2 ml样品管中研磨（每次最多96个样品），将茎组织在15 ml样品管中研磨（每次最多12个）。冷冻样品以1750 rpm的速度研磨1min，而后在−80°C的温度下冷冻30分钟，然后再循环破碎一或两次。使用刮刀将提取所需的粉末量（根据初步评估的体积/重量）转移到新的试管中。

溶液和试剂

CTAB缓冲液：CTAB 2%，NaCl 1.4M，EDTA 20 mM，Tris–HCl 100 mM，PVP40 2％
异丙醇 100％
DTT（DL-二硫苏糖醇）0.5 mM
SDS 10％
70％乙醇
DNase Ⅰ+ DNase缓冲液
RNase A

RNA提取

组织裂解

将0.5–50 mg（不用更多）的研磨样品转移到2 ml试管中。

加入625 µl CTAB缓冲液和25 µl DTT 0.5 mM（使用前将其混合）。

充分涡旋并在60°C下培养15分钟，每5分钟涡旋一次。

仅适用于困难样品：添加65 µl SDS 10％，并充分涡旋（如果只有少量组织，则仅添加40 µl SDS10％）注意：在此阶段，SDS与CTAB一起沉淀，使样品浑浊。

在室温下以20,000 g离心15分钟。（注意：组织碎片将在试管底部沉淀，SDS / CTAB将在表面形成半固体层）

从离心机中小心地移出试管，并将550–600 µl液相转移到新的2 ml管中或转移到96孔板中，然后进行核酸沉淀。注意：1、如果错误地吸收了太多的顶层，请将样品放入新的2 ml试管中，然后重复此步骤（提示：第二次离心后，直接从试管的底部吸取样品，顶层会粘在移液枪的枪头的外侧）。2、根据组织的不同，可能会形成不同的沉淀物（牛油果的芽就是这种情况）。此时转移到过滤柱（QiagenQIAshredder或Macherey–Nagel NucleoSpin过滤器）中，而不是2 ml管中，并重复此步骤。

核酸沉淀

在每个管、深孔板孔、涡旋孔中加入550 µl预冷（-20°C）的异丙醇；

在-20°C下放置15min。注意：在此阶段，您可以将样品在-20°C下放置几天或几周；

样品管、深孔板在4℃下离心，深孔板1小时、3100g，样品管45分钟 20,000g；

倾斜管/板以除去异丙醇；

加入1mL70％乙醇；

在4°C下度离心10-15min（3100g对深孔板，20,000 g对离心管）；

倾斜管/板以除去乙醇；

对深孔板/样品管短暂离心，并用移液管除去残留的乙醇；

让样品在工作台上干燥10分钟。

DNase处理

加入175 µl无RNase的水，上下吸匀，重悬沉淀；

将深孔板在50–60°C下放置2–3分钟，快速涡旋；

每个样品管或深孔板每个孔加入20 µl DNase和5 µl DNase I混合液（提前混合好的）；

快速涡旋，快速旋转并在37°C下培养20–30分钟；

立即进行下一步。

RNA沉淀和洗脱

在每个管/孔中加入200 µl预冷（-20°C）异丙醇并涡旋孔；

在-20°C下放置15min（注：在此阶段，您也可以将样品在-20°C下放置几天）；

深孔板在3100 g、4°C离心1 h，样品管在20,000 g、4°C离心45 min；

倾斜样品管/深孔板以除去异丙醇；

加入1mL70％乙醇；

在4°C下离心10-15分钟（对于深孔板3100g，对于样品管20000g）；

倾斜样品管/深孔板以去除乙醇；

短暂离心，并用移液枪除去残留的乙醇；

让样品在工作台上干燥10min；

加入40–100 µl温的（60°C）不含RNase的水，并用力上下吸匀；

快速涡旋；

通过凝胶电泳和分光光度法确定RNA的数量和质量，并将样品保存在-80°C。

DNA提取

组织裂解和RNase处理

将最多50 mg的初始样品转移到2 ml样品管中；

加入400 µl CTAB缓冲液和4 µl RNase A + RNase缓冲液（如前所述提前混合好的）；

37°C下充分涡旋1h，并每15分钟反转一次；

加入30 µl 10％的 SDS，并充分涡旋（如果使用少量组织（<10–15 mg），则仅添加15 µl 10％的SDS）；（注意：SDS与CTAB一起沉淀，使样品浑浊）

在室温下以20,000 g离心15分钟；（注意：组织碎片将在试管底部沉淀，SDS / CTAB将在表面形成半固体层）

从离心机中小心取出，并将350–400 µl上清液转移到新的2 ml样品管中或2 ml 96孔板中，进行核酸沉淀。（注意：1、如果错误地吸收了太多的顶层，请将样品放入新的2 ml试管中，然后重复此步骤（提示：第二次离心后，直接从试管的底部吸取样品（顶层会粘在枪头的外侧）。2、视组织而异，如果形成脏/不清晰的沉淀物（牛油果的芽就是这种情况），需转移到过滤柱（Qiagen QIAshredder或Macherey-Nagel NucleoSpin过滤器）中，而不是2 ml试管中，然后重复此操作步。）

DNA沉淀和洗脱

向每个样品管/深孔板孔和涡旋孔中加入350-400 µl预冷（-20°C）的异丙醇；

在-20°C下放置15min；（注意：在此阶段，您也可以将样品在-20°C下放置几天）

4℃下离心，深孔板：3100g、1小时，样品管：20,000g、45min；

倾斜样品管/深孔板以除去异丙醇；

加入70％乙醇1mL；

在4°C下以3100 g的速度离心10-15min（对于深孔板）或20,000 g（对于离心管）；

倾斜样品管/深孔板以除去乙醇；

快速离心样品管/深孔板，并用移液枪除去残留的乙醇；

让样品在工作台上干燥10min；

加入90 µl温的（60°C）的无RNase的水，上下吸匀并充分涡旋以重悬沉淀。

数据统计与质量控制

通过在1.1％琼脂糖凝胶上电泳RNA或DNA样品进行质量控制。核酸通过加入Red Sage染色^®到凝胶。使用Gel Doc™系统（美国加利福尼亚州的Bio-Rad实验室）进行凝胶可视化。用NanoVue™ Plus分光光度计（GE Healthcare LifeSciences，宾夕法尼亚州，美国）测定样品的质量和纯度，测量RNA在280 nm和DNA在260nm的吸光度。

cDNA合成和定量实时PCR（qRT-PCR）

对于qRT-PCR，按照生产商的说明，通过在8 µl和2 µl的5×iScript Supermix（美国加利福尼亚Bio-Rad实验室）中使用250–500 ng的总RNA进行反转录获得cDNA。然后将cDNA稀释至每微升超纯水中0.5 ng当量RNA，用于工作模板溶液。然后定量实时PCR，每个反应试剂盒使用2微升的1mM的引物混合物，5μl cDNA和3μl SensiFAST™SYBR ®No-ROX Kit（Bioline）。按照生产商的说明扩增样品，并使用CFX384 Touch™实时PCR检测系统（美国加利福尼亚州Bio-Rad实验室）检测荧光。

cDNA合成和miRNA表达定量

为了定量miRNA的表达，按照生产商的说明，使用miScript Plant RT Kit（Qiagen，荷兰）试剂盒，通过连接反转录介质，从100到200 ng总RNA反转录合成低分子量cDNA。然后根据生产商的说明，使用超纯水稀释制备的cDNA，以实现最佳扩增。所述的qRT-PCR反应按照生产商的说明书（miScript SYBR Green PCR试剂盒，Qiagen，荷兰）进行使用：10μl的1×QuantiTect SYBR ®绿色主混合物，2微升1×miScript通用引物，2μl的0.8μM的miRNA特异性引物和2 µl模板cDNA。进行qRT-PCR运行，并使用Rotor-Gene Q 6000（Qiagen，荷兰）测量荧光。

RNA-Seq库的制备和测序

如Kerr等人所述制备RNA库的方式，准备牛油果、夏威夷果和芒果的茎、叶、根、花和腋芽组织。然后按照生产商的说明（Evrogen JSC，莫斯科，俄罗斯）使用Trimmer-2 cDNA标准化试剂盒对cDNA库进行标准化。使用CFX96 Touch™实时PCR检测系统（美国加利福尼亚Bio-Rad实验室），使用Illumina测序平台的库定量试剂盒（KAPA Biosystems，美国波士顿），通过qRT-PCR对库进行定量。使用从qRT-PCR计算的摩尔浓度将库标准化为4nM的工作浓度，并调整片段大小。然后使用Illumina测序仪（NextSeq）对RNA-Seq样本进行测序。

RNA-Seq读取质量控制评估和定位

Trimmomtatic v. 0.35 用于去除启动子，根据质量修剪和过滤读取结果。使用Deconseqv. 0.4.2，从读取结果中去除序列污染物。使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）检查序列读取质量。

为了验证我们的RNA测序结果，我们将读段映射到已发表的转录组和基因组序列草案中。使用HISAT v.2（默认设置）将修剪的读取结果映射到已发布的参考转录组和基因组序列中。

03 结果

无苯酚/氯仿的CTAB / PVP / SDS-based RNA提取

在下面介绍的第一批实验中，我们开发并测试了一种使用40-60 mg牛油果、夏威夷果和芒果成熟叶片的冷冻叶组织提取RNA的方法。在发表的文献中，用于困难树种开发的大多数RNA提取方法，通过使用CTAB / PVP裂解缓冲液中调高盐（NaCl）浓度，可以提高RNA产量和质量。因此，我们使用该缓冲液裂解我们的样品。大多数提取方法都使用此缓冲液来提取RNA，同时联合使用苯酚/氯仿法从蛋白质中分离出核酸。但是，我们不使用苯酚和氯仿，因为它们具有毒性，同时它们不可能在96孔板中实现高通量。因此，我们决定通过加入一定量的异丙醇，并在裂解步骤后离心样品，来得到RNA沉淀（图1）。在这个阶段，蛋白质和不需要的化合物（如多糖和多酚）会溶解在上清液中，并且很容易可以除去。用乙醇洗涤沉淀后，将核酸重悬，并进行DNase处理，然后在异丙醇中进行另一轮沉淀并洗脱以回收RNA。图2中的质量控制显示RNA未被降解，并且260/280的比率高于1.79，表明提取过程中蛋白质被去除。260/230的比例在1.2至1.56之间，具体取决于物种，这表明残留了一些多糖。

为了改进方法，在60°培养步骤后将1％SDS添加到裂解缓冲液中。SDS是一种清洁剂，可帮助消化细胞膜并在此步骤中释放更多核酸。SDS还具有破坏核酸/蛋白质相互作用，并促进CTAB /核酸复合物溶解的特性，从而改善了核酸的沉淀并提高了产量。用SDS本身提取的样品获得的RNA产量比CTAB/ PVP缓冲液更好。但是，260/230的比例非常低（1.07），无法防止样品氧化（图3a）。结合CTAB和SDS方法来改善产率（图2、3）。这在夏威夷果中尤为明显，其RNA产量几乎翻了一番。如通过裂解步骤后的样品颜色观察（图 3a），CTAB / PVP和SDS的组合也抑制了样品氧化和叶绿素变性，这是SDS的已知作用。CTAB和SDS之间的相互作用形成微胶束，产生可见的混浊沉淀，导致离心后在缓冲液和空气之间界面处形成半固体白色层。

因没有CTAB或样品管中有植物组织，SDS对产量的影响并未降低（图3）。这表明在该方法中，SDS对产量的影响可能是由于其从核酸中分离蛋白质的能力，而不是其组织裂解活性或其溶解CTAB /核酸复合物的性质。此外，添加SDS还可略微提高牛油果和夏威夷果的260/230比例，这表明CTAB和SDS的组合可在最终洗脱过程中稍微降低多糖含量（图3）。

从不同组织类型中提取RNA

然后，我们测试了该方法对于不同类型的组织是否有效。为了测试这一点，我们使用15–30 mg的四种不同夏威夷果组织（叶、茎、花、腋芽）进行了相同的步骤。质量/数量控制表明，该方法对夏威夷果的这四种组织类型均有效（图4）。还对根组织进行了测试，但结果不一致，不能认为是成功的（数据不包括在内）。从茎和休眠腋芽中提取的RNA量要少于从叶和花中提取的RNA，这可能是由于这种组织中所含的活细胞数量较少。对于所有组织，260/280均高于1.79，表明蛋白质已从样品中有效去除。260/230比值较低，这可能是由于这些组织类型中包含大量次要化合物。

使用96深孔板提取RNA

我们希望能开发一种可以同时提取大批量样本的方法。为了实现这一目标，我们注意到该方法的一个特点：在裂解步骤之后，该方法不需要在通风橱中进行移液，不像使用苯酚和氯仿的方法一样。因此，我们在2 ml 96深孔板上使用与样品管进行相同的步骤。与样品管结果相比，使用深孔板提取的结果令人满意，可以在图5中所示的质量控制结果看出。且使用96深孔板方法，仅需一天即可提取96个样品（不包括研磨时间），而使用96通道的移液器（PLATEMASTER，Gilson）可以使花费的时间更短。

实时定量PCR和RNA-Seq读取质量控制

为了证明提取方法所产生的RNA质量足够好，我们使用RNA进行实时定量PCR和RNA测序。用DORMANCY1（DRM1）和miR172在三种树种中获得的扩增（图 6）和解链曲线（附加文件1：图S1）证明，RNA可成功用于定量RT-PCR（图 6）。这些结果表明，即使在某些样品中260/230比值不是最佳的，用这种方法分离的RNA的质量也足以进行基因和miRNA定量分析。

为了进一步证明我们的RNA提取方法的适用性，我们使用该方法为牛油果、夏威夷果和芒果树中的每一种样品制备标准化的RNA-Seq库，并使用Illumina测序技术对其进行了测序。使用此方法获得的基因库质量控制数据表明，使用本文所述方法提取的RNA质量很好，完全满足RNA提取实验要求（图 7和附加文件2：图S2）。在使用Trimmomatic进行标准修整和质量控制后，使用FastQC版本0.11.5（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行质量评估，数据表明质量良好（图7），且具有统一的高质量碱基调用，以读取正向（图 7）和反向（附加文件2：图S2）序列的末尾。这说明大多数序列读数均为高质量，这为后续的遗传分析提供了保障。

序列映射检测

为了验证我们的RNA测序，我们使用HISATv.2（默认设置）将修饰后的序列映射到已发布的转录组和基因组序列中（如表1）。我们牛油果样品中有76％和80％的读段映射到Persea americana var'drymifolia' and cv. ‘ Lisa’转录组序列集中。我们芒果样品的读段中有66％和69％映射到印度芒果（Mangifera indica L. cv. 'Shelly' and 'Zill'转录组序列集中。我们夏威夷果样品中有79％的读断映射到夏威夷果Madamadia integrifolia cv. 741 ‘Mauka’基因组序列集草案中。这种质量控制进一步支持了用我们的方法提取的RNA的质量足以进行各种转录组学研究。

无苯酚/氯仿的CTAB / PVP /SDS-based DNA提取

对树木进行DNA提取方法时通常遇到的问题与RNA提取方法相同。因此，我们决定测试这种RNA提取方法是否可以转换为基因组DNA提取方法。为实现此目的，我们通过用RNase代替CTAB缓冲液中的DTT来修改方法，以在裂解步骤中去除RNA。对于RNA提取，在裂解步骤结束时添加1％的SDS，并执行一次沉淀/洗涤/洗脱循环以回收纯化的DNA（图8）。我们的样品还包括来自室外种植的咖啡树和桉树的成熟叶片样品，这两个物种在DNA提取方面众所周知是有挑战性的。图9所示的是质量和数量控制结果，图示表明，所获得的提取量令人满意，并且提取的DNA没有降解。因此证明，该方法可以转化为困难的热带和亚热带物种样品的DNA提取方法。

04 讨论

A safer version of the CTAB/PVP-based extraction methods
Successful nucleic acid extraction from species recal citrant in molecular biology requires the use of CTAB/ pyp-based buffers. The results we described here clear demonstrated that this buffer was efficient to extract RNA and DNA from different tropical and subtropical species using challenging for this type of experiment. We also highlight that SDS-based buffer, used in some pro cedures, cannot subsidise the CTAB/PVP buffer without leading to an undesirable browning of the tissue (oxidation) companied with low 260/230 ratio.
Although the CTAB/PVP-based methods are giv ing good results in term of RNA yield and quality, these methods not compatible with the increasing concern for health safety in the scientific community, due to the large amounts of phenol and chloroform used in these meth ods. Our results show that it is possible to precipitateRNA directly after the lysis step. However, RNA yields are low, especially for macadamia, a crop underrepre.sented in molecular studies. Although, CTAB and SDS react together to form micelles, adding 1% SDS at the end of the lysing step with a CTAB/PVP-based buffer could increase the RNA yields. This increase in final RNA yields was likely to be due to the property of SDS to separate proteins from RNA, since the effect of SDS on yield did not rely on the presence of CTAB or plant tissue in the reaction (Fig. 3)

High recovery yields with small amounts of tissue
In this experiment described in the Fig. 4, the RNA yields for leaves from recalcitrant species were higher than in the experiment described in Fig. 2 and were quite com parable to the vields extracted from Arabidopsis or pea leaves (Additional file 3: Fig. S3). Additionally, the ratio 260/230 was also improved compared to the experiment in Fig. 2. These differences may be explained by the dif ferent amounts of fresh tissues which were used in these two experiments and suggest that this method is more efficient when performed with less fresh tissue. Interest ingly, the results obtained on single pea buds (less than 0.5 mg) demonstrate that RNA recovery is very high (Additional file 3: Fig. S3). This suggests that this pro cedure gives better results with small amounts of tissue (less than 25 mg) and that this method can be used to recover high RNA vield, which is an advantage for sam ples for which on small amount of tissue can be collected.

Facilitating molecular studies in orphan crops

Avocado, macadamia and mango can be classified as orphan crops as they are agriculturally important yet they are not well studied and therefore have limited genetic and genomic resources [38]. The impractical ity and unsafety of the published nucleic acid extraction methods working with these crops is likely to contribute to this effect. The methods we developed in this study demonstrate that this simple and safer procedure allows to extract quality RNA foar qRT-PCR from mRNA and also microRNA which are of emerging importance in molecular plant biology. Moreover, the method described here is compatible with sequencing technol ogy. This aspect is important since transcriptomic anal ysis are now routinely performed in laboratories. Our method will hopefully contribute to bridging the gap between model crops and these orphan crops.