肽-类肽杂交体的反相快速色谱纯化

应用概述

-类肽杂交体或肽聚体是寡聚合成的聚合物,其中一个或多个氨基酸被类肽亚单体取代。其关键结构特征是氨基酸的侧链从α-碳重排到肽键的相邻氮原子(参见图1)。通常,这类物质表现出与亲本肽相似的理化特性。

-类肽杂交体的纯化可以通过具有出色回收率和分辨率的反相色谱法获得。通常,优化肽和类似化合物混合物的分离,最好是考虑调整参数,比如上样量和固定相的粒径。本应用将讲述,使用Teledyne ISCORediSep® C18反相色谱柱作为固定相,从肽副产物中分离出肽聚体。

1. 肽和

 

实验部分

使用 Teledyne ISCO CombiFlash® NextGen 300+,在RediSep®Rf C18 4.3g色谱柱和 RediSep Rf C18 Gold® 5.5 g色谱柱上,分别实现了一种肽聚体和一种相近的肽的混合物分离(如图3所示,在20分钟的H2O/MeCN梯度中,保留时间分别为9.348.06分钟)。表1给出了 肽聚体及其副产物的序列,其中副产物的分子结构比母体化合物少一个氨基酸。本研究中保持不变的参数在表2给出,变化的参数在表3中。

用低分辨率LCMS Waters TQD质谱仪对粗制和纯化的肽聚体进行表征,色谱柱使用Agilent ZORBAX SB-C18 Stable Bond Analytical5μm粒径,4.6x150mm),流动相为MeCN/H2O二元洗脱体系,20分钟梯度从90% H2O/10% MeCN100% MeCN(含 0.1% 甲酸)。喷雾电离质谱在正离子模式(m/z范围:600–1900)运行,锥孔电压为50V,去化温度350℃,源温度为100℃

结果

用少量肽-肽聚体混合物(8mg)加载到C18反相4.3g RediSep色谱柱(运行1),使用水/甲醇作为流动相快速且成功地分离了产物(图1)。此时分离不需要配对离子试剂(如TFA)。当使用C18反相5.5 g RediSep Gold 色谱柱时,对于相同的上样量(8mg),可获得更高的峰分辨率(图 2,运行2)。

当加载更大量的粗混合物(16 mg)时,使用常规RediSep C18 4.3g色谱柱(运行3),出现分辨率损失的情况。相比之下,使用RediSep Gold C18 5.5g色谱柱(运行4),在同规模下可成功实现分离。这就充分说明了,在扩大分离规模时使用较小粒径色谱柱的重要性。金标柱固定相组合物采用获得专禾刂(US2023411505A1)的球形Flash介质,可在不增加背压的情况下提供更紧密的填充。与标准快速色谱柱相比,分辨率提高了一倍,可以分离具有低ΔRf的困难化合物,例如母体肽聚物和截断副产物,同时,可以加载两倍的化合物,也不会使峰的分辨率损失。

2. 通过改变样品量和色谱柱介质获得的分离色谱图。

3. 分离前后的HPLC色谱图。

组分1包含母体序列的副产物,而组分2包含需要纯化的肽聚体。

结论

与传统快速色谱法相比,通常通过反相制备型HPLC实现极性化合物的分离,如肽和类肽模拟物,因为其分离能力通常更高。即使在使用反相液相色谱时,分离具有一或两个氨基酸差异的高度相似的肽也非常困难。制备型HPLC的使用也很耗时,需要昂贵的色谱柱,而且运行时每次的样品加载量可能也很有限,因而要多次进样。预装的C18反相柱为快速色谱提供使用便利,并且其制备分离与自动快速色谱仪具有可比性。

在本工作中,使用快速色谱预装柱成功地实现了肽聚合物与其副产物的分离。在更短的运行时间(8.8 分钟)内,同时允许加载更高的粗样品量并获得与制备型HPLC相当的纯化结果。峰的分辨率明显受色谱柱粒径和负载量的影响,表明对于更高的负载量和较困难的分离,由RediSep Gold C18技术的超高度分辨率是分离成功的关键。

 

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