【Application Note】利用微波快速高效水解宠物食品中的氨基酸

发布时间:

2022-11-09

概要：微波辅助反应已被强调为一种显著缩短水解时间、提高反应产率和重现性的方法。CEM的Discover®2.0为优化蛋白质水解反应提供了一条极好的途径。Discover2.0具有关键的优点，包括更短的反应时间、更清洁的水解产物和更快的分析时间。

介绍

蛋白质在湿宠物食品和干宠物食品的生产过程中起着重要作用。蛋白质的质量和数量不仅影响生产的总成本，还影响消费者对产品的兴趣。评估膳食蛋白质质量的一种方法是通过氨基酸水解检查样品的总氨基酸含量。通常，蛋白质在酸性或碱性条件下水解 24 小时以上。这种处理打破了蛋白质中氨基酸残基之间的肽键，蕞终实现了每个氨基酸的鉴定和定量。由于常规加热的特点是缓慢的体积加热、不稳定的热梯度和不一致的反应产率，因此需要较长的反应时间。

微波辅助反应已被强调为一种显著缩短水解时间、提高反应产率和重现性的方法。 1,2 CEM 的 Discover®2.0 微波反应器为优化蛋白质水解反应提供了一条极好的途径。在此，对湿和干宠物食品进行传统的酸水解以及优化的微波辅助水解条件。使用 Waters AccQ Tag™ 超衍生试剂盒，通过柱前衍生法测定每个样品的氨基酸含量，然后在 260nm 下进行 LC-PDA 分析。总的来说， Discover 2.0 的结果较优于传统水解，且具有关键的优点，包括更短的反应时间、更清洁的水解产物和更快的分析时间。

材料和方法

试剂和样品

化学品从商业供应商处购买，未经进一步纯化即可使用。用于传统和微波辅助氨基酸水解的溶液在使用前新鲜制备。所有玻璃器皿在 110°C 的空气烘箱中干燥 4 小时。所有宠物食品样品均化并储存在阴凉干燥的地方（对于干样品）或 4ºC （对于湿样品），直到分析。使用分析天平将每个样品的 40 至 50mg 部分称重到其反应容器中。使用 Waters AccQ Tag Ultra Derivation 试剂盒分析所有样品，用于 260nm 下的 LC-PDA 分析。

传统酸水解法

将宠物食品样品加入清洁干燥的 10 mL 玻璃瓶中，然后加入 2 mL 6 N HCl 。然后用 N2 吹扫小瓶，快速密封，然后放入 110°C 空气烘箱中 24 小时。将样品水解物冷却至室温，然后通过 0.2 µm PTFE 过滤器。然后用 6M NaOH 中和无颗粒样品，以准备 AccQ Tag 衍生化。

Discover 2.0 水解方法

水解反应制备：将各样品的 50 mg 部分添加到配备有微搅拌棒的 35 mL Pyrex 容器中。用移液管将 5mL 体积的含 1% 苯酚（ w/v ）的 6N HCl 移到每个容器中。用 N2 流吹扫容器 5 分钟，用 Tefon 内衬硅帽快速密封，并放置在自动取样器架中，以便自动放置到 Discover 2.0 腔中。反应完成后，将冷却的样品中和并过滤，以准备 AccQ Tag™ 衍生化。

方法编程：在 Discover 2.0 系统中编程一步动态法，用于宠物食品样品的氨基酸水解。

酸水解

容器类型： Pyrex

控制类型：动态

温度： 160°C

时间： 30 分钟

压力： 300 PSI

功率： 300 W

搅拌：高

分析样品制备

对于 AccQ Tag 衍生化，将来自 Waters AccQ Tag-Ultra 衍生化试剂盒的 70µL 硼酸盐缓冲液添加到完整的回收小瓶中，然后添加 10µL 过滤和中和的样品。将小瓶盖上并使用旋涡混合器混合。此外，将 20µL 从 Waters 试剂盒制备的衍生化试剂添加到每个样品反应中，移液管尖端直接置于反应溶液中。在分析之前，将总反应涡旋 10 秒，然后在 55 ℃下加热 10 分钟。

分析

将 4µL 每种衍生反应注入 ACQUITY™ 上变频器 ™ 系统，连接到 Waters PDA 探测器。在 Waters AccQ Tag Ultra C18 柱（ 1.7µm ， 2.1 x 100 mm ）上以 0.4 mL/min 的流速进行分离。柱温为 55 ℃。洗脱梯度如表 1 所示。流动相为 A:Waters AccQ Tag 洗脱液 A ，在 MilliQ 水中稀释 10 倍， B:Waters-AccQ Tag-Eluent B 。为了测定每种氨基酸的氨基酸浓度，将 Waters 氨基酸标准品（ Waters Corporation ，零件号 WAT088122 ）衍生为以下浓度： 1 、 5 、 10 、 25 、 50 和 100 pmol/µL ，并且所得到的线性曲线被强制通过零。所有分析均使用 Waters TargetLynx 软件 ™ 进行。

表1. 用于衍生氨基酸分离的梯度

结果和讨论

使用 CEM 的 Discover 2.0 微波反应系统对干狗（猫）粮和湿宠物食品样品进行微波辅助氨基酸水解。每种水解产物的氨基酸含量通过柱前衍生化测定，随后通过配备 PDA 检测器的 LC 分析测定， PDA 检测器设置为在 260nm 下监测。将结果与从相同样品的传统烘箱水解反应获得的结果进行比较。传统的结果被认为是 100% 的回收率。表 2 描述了每个氨基酸残基与其传统水解对应物的回收率。对于干和湿宠物食品样品，所有回收率均在可接受的回收率范围内，即 60 至 130% 。此外，与传统水解反应相比，微波辅助反应的标准偏差更高（如图 1 所示）。

与传统水解反应相比，微波辅助反应在标准偏差方面表现出更高的精度（如图 1 所示）。

Discover 2.0 与传统氨基酸水解协议相比具有多种优势。添加磁搅拌有助于样品的均匀性，而压缩空气冷却使反应容器在几分钟内达到安全的处理温度。 Discover 2.0 的微波加热机制提供了与传统加热相当的结果，在 30 分钟内提高了精度，从而缩短了分析时间，并为反应优化提供了更大的机会。该方法还代表了用于酸和碱氨基酸水解反应的安全和自动化平台。

表2. 干湿宠物食品中氨基酸的回收率——微波辅助与传统氨基酸水解

图1. 湿宠物食品的氨基酸水解结果

结论

这项研究强调了 CEM 的 Discover 2.0 是一种有效的方法，可用于湿宠物食品和干宠物食品的氨基酸水解。总的来说， Discover 2. 0 的结果在准确性和精密度方面较优于传统的烘箱水解结果，主要优点是反应时间更短、水解产物更清洁、分析时间更快。

参考文献

1 Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987 , 30 , 572-576.

2 Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991 , 13 , 93-95.

AccQ-Tag™, ACQUITY™ UPLC™ , and TargetLynx™ are trademarks of Waters Corporation.

【Application Note】利用微波快速高效水解宠物食品中的氨基酸

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