CombiFlash 全波长收集和纯度测量
发布时间:
2025-10-23
概述
多年来快速色谱系统使用紫外可见检测器以控制馏分的收集，纯度的检测仅限于比例测量，这需要对化合物和杂质的光谱事先的了解，这样就可以使用正确的波长来收集化合物和确定纯度。
用户在定义范围内全波长的监测，可用于全波长收集这种技术，在该范围内的吸光度变化被视为另一个峰，并触发馏分收集器的收集或峰切割，通过实时溶剂背景抑制，全波长收集还可以用于测定所选择光谱范围内的峰纯度，此应用报告将介绍合成化合物和天然产物的应用案例。
背景
纯化化合物时，在未知化合物紫外光谱的情况下，全波长收集是一种非常有效的技术，天然产物的分离也是如此。当测量合成后的混合物紫外光谱时，目标化合物的紫外在所选择检测波长不合适情况下可能被有更强吸收杂质的光谱所掩盖，全波长收集方式有助于确保目标化合物被收集，即使存在溶剂导致的基线变化。当混合物不完全洗脱时，能够根据峰值纯度测量来解析混合物是有帮助的。在全波长收集方式下通过测量全部紫外光谱的纯度指数使得纯化化合物有可能性。
实验和结果
所有实验都是在CombiFlash 系统上进行的。 溶剂为VWR Scientific公司(Radnor, PA)的ACS级。 其他细节将在下面的章节中描述。
例1:绿茶初提物的纯化
1 g初提物溶解在甲醇中，吸附在含Celite 545 (Acros Organics)的RediSep®固体上样管(PN 69-3873-235)上，该化合物用正己烷:异丙醇梯度下和异丙醇:水梯度下，在15.5 g的 RediSep Rf Gold Diol色谱柱(PN 69-2203-515)上洗脱。生物碱和儿茶素在水梯度中一起洗脱，而单宁在水梯度中较早洗脱。使用全波长收集方式采集馏分。此纯化过程重复两次以提供例2的材料。
之所以使用二醇色谱柱，是因为单一的梯度运行可以捕获几乎所有的化合物，从非极性到水溶性。而且二醇色谱柱可重复使用多次。
图1:绿茶初提物的初始纯化全波长收集二醇色谱柱。颜色条表示馏分用于例2中的提纯。
根据薄层色谱法(TLC)和与真实样品比较，从10-21柱体积(CV)中收集和合并馏分。 22 CV处的峰可能是单宁。它们被发现不可逆地吸附在聚酰胺上。 全波长收集和跟踪完全匹配在254nm波长下的检测。
例2:检测其他波长的化合物（在C18色谱柱下纯化）
在例1中纯化1 g初提物吸附在Celite 545上在二醇上纯化的部分，使用含0.1% TFA(5%甲醇到95%甲醇)的甲醇/水梯度洗脱化合物，使用RediSep Rf Gold C18色谱柱(PN 69-2203-334)，采用全波长收集方式收集馏分。
图2:全波长检测黄酮类和黄嘌呤类生物碱
全波长收集方式能够检测出在单波长可见的所有化合物，尽管C18色谱柱上不完全的洗脱，由于儿茶素的浓度相对较低，且在254nm处吸收最小，但是全波长收集软件能够检测出在单波长处漏检的儿茶素，在这个例子中，使用全波长收集没有遗漏化合物的收集。
纯度测定
CombiFlash 系统的PeakTrak®软件可存储光谱信息，对模拟色谱，紫外光谱采集自CombiFlash系统，测定每个化合物在λ-max下的馏分数(分别进行)，以及每个化合物的保留时间，然后使用分配色谱模型模拟出色谱图，模拟生成了消除仪器噪声后的数据集，验证了模型的有效性。
将1∶1水esculin: 4-nitrophenyl-(D)-glocopyranoside吸附在Celite(10%样品吸附在Celite上)上制备色谱样品。
样品(285 mg)在调整后的水/乙腈梯度上运行，使峰重叠在13 g RediSep C18色谱柱上(PN 69-2203-411)。 另一个运行咖啡因和茶碱是由1:1的咖啡因:茶碱在Celite上(10%的样品在Celite上)生成的，此混合物(0.5 g)在12 g RediSep Rf硅胶柱(PN 69-2203-312)上用100%乙腈洗脱。
采用最小二乘比较、相似指数、光谱对比和Pearson相似指数等算法对峰纯度进行评价，选择相似指数是因为真实数据最符合模拟色谱图的理论预测。
图3:模拟色谱图(右二)展示了使用皮尔逊法对峰纯度的评价。 前两种为模拟色谱图; 左面两个是应用于实际化合物洗脱的相似指数。 将复合谱图插入仪器运行数据中。 光谱与咖啡因和茶碱相似的化合物似乎在重叠峰上产生了相似指数，但很难说实际样品运行中的相似指数不是由于仪器噪声造成的。
结论
在化合物的最大吸光度未知情况下，可以采用全波长收集技术对其进行检测和馏分收集。全波长收集可以补偿由溶剂吸收引起的基线漂移，生成的化合物和样本装载导致在给定波长紫外检测器的饱和峰也可以用全波长进行分馏收集，全波长检测的扩展也可用于评价化合物纯度，甚至不完全洗脱相关的化合物，除紫外光谱外，纯度测定还可应用于其他检测方法，如质谱法。