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用SPEX Geno Grinder 组织研磨仪高通量破碎96孔板中的酵母菌

用SPEX Geno Grinder 组织研磨仪高通量破碎96孔板中的酵母菌

2017/07/26 16:18
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图3. 用425-600目玻璃珠振荡10分钟的细胞裂解的效果。绝大多数酵母菌已经破碎呈现出黑暗的细胞“鬼魂”阴影,极少几个酵母菌没有被振荡破碎而呈现出明亮的部分。

 

摘要

 

多年生化、遗传学和分子生物学的研究成果已经使得酵母菌成为一种最受欢迎的基因表达研究和蛋白质重组表达的通用宿主,成为生物系统研究的模式型生物,是生物制药科学家的有力工具。尽管包括Pichia、Hansenula、Debaryomyces均被研究者所使用,但使用最普遍的依然是Saccharomyces酵母。

 

酵母菌mRNA 和细胞内蛋白,很难用传统酶解方法完整提取。裂解酶中通常含有核糖核酸酶和其他蛋白酶,它们不仅会破坏细胞壁,且会破坏特定分子。另外,酶解产生的原生质体,需借助特定试剂进行溶解,而导致很多蛋白质变性失活。因此常常需要使用物理方法破碎酵母菌,从而释放内容物。

 

通常的压榨或球磨方式,每次只能处理一个样品,操作效率太低。对于那些需要进行高通量筛选检测酵母菌的实验,单个处理是一个主要的瓶颈和不切实际的,所以我们就需要一种可以单次高通量裂解细胞的方法。Geno/Grinder组织研磨仪——一个最初是为了在深孔板中高通量破碎种子而设计的垂直振荡研磨仪就可以很好的解决这一问题。可同时在6个96孔深孔板中对酵母菌进行破碎。实现高通量地裂解酵母。

 

材料和方法:

 

酿酒酵母在YPD培养基((1% 酵母提取物, 2% 蛋白胨, 2% 葡萄糖))中30°C下150 rpm振荡过夜培养,使用无菌96孔板(CorningLife Science),每个孔中加入100 ml 培养液和酸洗的玻璃珠(Sigma,G-8772)。使用一系列不同尺寸的玻璃研磨珠(106 目 (非常小),150-212 目,212-300 目,425-600 目(大).)对照组酵母菌中只加入培养液不加玻璃研磨珠。盖上橡胶密封垫密封后放入Geno/Grinder动植物组织研磨机内,固定好。 1500转/分钟下振荡5-10分钟。完成后,用相差显微镜检查酵母培养物并拍照。

 

结果和讨论:

 

酵母裂解的有效性取决于玻璃珠的大小和研磨持续的时间。图1-3是用425-600目玻璃珠振荡5-10分钟的细胞裂解的效果。在裂解细胞时,玻璃珠的目数越低效果更差,106目的玻璃珠尤其没有效果。结果表明425-600目的玻璃珠是最适合裂解Saccharomyces的。

 

Geno/Grinder组织研磨仪的独特设计也是裂解过程中一个重要的因素。标准的珠磨研磨机适应微孔板的应用模仿“油漆搅拌器”设计,呈8字形运动。这种运动方式不能使样品得以均一的裂解,样品间差别很大。而Geno/Grinder的垂直振荡模式则能有效的裂解多孔材料中的样品,这种上下垂直运动方式使得玻璃珠更直接的碰撞细胞(而不会像一般的珠磨除了碰撞细胞外也常常会碰撞孔壁),从而能够得到均一的研磨效果。

设计理念

图1. 对照组未加玻璃珠的酵母菌。10分钟后,这些酵母菌依然完好无损。

 
 
 

图2. 用425-600目玻璃珠振荡5分钟的细胞裂解的效果。破碎的酵母像是黑暗的“鬼魂”,完整的酵母菌则继续折射光而呈现出明亮的部分。

 

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