吴思霖,王欣美,于建,潘晨,王柯
（上海市食品药品检验所）
摘要：建立了一种有效分离检测鸡肉及鸡肝样品中洛克沙砷(ROX)、阿散酸(ASA)、硝苯肿酸(NPAA)、卡巴肿(CBS)、砷酸(As V)、亚砷酸( As I1 )、一甲基肿酸(MMA)、二甲基肿酸(DMA)、砷甜菜碱(As B)和砷胆碱(As C)共10种砷形态化合物的高效液相色谱-电感耦合等离仔体质谱(HPLC-ICP-Ms)分析方法。采用10%甲醇为提取液，碳酸铵溶液为流动相，以阴离子分析柱将样品提取液进行分离，最后进行 ICP-MS测定。10种砷形态化合物在0.1~100 pg/L范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.999，检出限为0.3~1.5 Lg/kg，定量下限为1.0~5.0ug/kg，加标回收率为81.3%-97.7% ，相对标准偏差为0. 1% 3.5%。该法重现性好、灵敏度高，且采用组织研磨仪机械振荡5 min即可成功提取10种砷形态化合物，与常规水浴加热振荡提取相比更加简便、高效。该法适用于鸡肉及鸡肝样品中10种砷形态化合物的同时检测，鸡肝样品中检出阿散酸和亚砷酸。
自1996年我国农业部批准有机肿制剂在动物饲料中使用后，阿散酸(ASA)、洛克沙砷(ROX)、卡巴肿(CBS)和硝苯肿酸(NPAA)等有机肿类制剂作为饲料添加剂已广泛应用于畜禽养殖业。由于有机砷类制剂具有刺激动物生长的作用和较广的抗菌谱，可改善禽畜肉质、提高饲料利用率，使动物呈现出 ，皮肤红润、皮毛光亮”的健康假象，进而造成禽畜养殖业有机肿类制剂被滥用乱用的现状[1-5]。然而，有机肿制剂具有一定的毒性，会影响人体内酶的活性使其失活，导致细胞代谢紊乱，进而造成中枢神经系统失调，脑病的发病率升高[6-7]，还可通过食物链危害人类健康[8]。因此开发一种可同时测定多种砷形态化合物的分析方法具有重要的现实意义。
目前国内外常采用高效液相色谱法( HPLC) [53、气相色谱-质谱法(GC-MS )[9]、液相色谱-氢化物发生-原子荧光法(HPLC-AFS) [10-12]、高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱( HPLC-ICP-MS)联用16.13-13等分析砷形态化合物。HPLC-ICP-MS联用技术因具有灵敏度高、检出限低、线性范围宽等优点，近年来已成为砷形态分析中最具应用前景的技术之一。
目前文献中大多采用水浴加热超声或振荡提取砷形态化合物，但方法耗时长(>2 h)且易导致有机肿的损失。本研究拟采用组织研磨仪机械振荡提取，建立一种有效分离检测ROX等10种砷形态化合物的HPLC-ICP-MS方法，以期为相关食品的监督检验提供方法参考。
1、实验部分
1.1仪器与试剂
7700型电感耦合等离子体质谱仪、1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司); 1500型组织研磨仪(美国SPEX公司); T25 Digital ULTRA TURRAX型均质仪(德国IKA公司); 5810R型高速离心机(德国Eppendorf公司); Milli-Q Advantage A10超纯水仪(美国Millipore公司)。
ROX等10种标准物质，纯度均在98%以上(Dr. Ehrenstorfer或国家标准物质中心);甲醇(色谱纯，德国Merck公司);正已烷(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)、碳酸铵(分析纯，国药集团)。
混合标准工作液:分别精密移取适量ROX， ASA， NPAA， CBS、砷酸(As V)、亚砷酸(As I1)-甲基肿酸( MMA)、二甲基肿酸(DMA)、砷甜菜碱(As B)和砷胆碱(As C)，用水溶解稀释配制成质量浓度为1.0 mg/L(以As计)的混合标准溶液。
样品:鸡肉和鸡肝样品购于上海各大农贸市场、家禽店。组织样品匀浆后于-20 ℃冷冻保存 &Н。
1.2 高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱条件
1.2.1 色谱条件
色谱柱:阴离子分析柱Dionex lonPac AS 7 (250 mm ×4 mm)和阴离子保护柱Dionex lonPac AG7 (50 mm ×4 mm);柱温:室温;进样量: 25uL;流速: 0.8 ml/min。流动相: A为3.85 mmol/L碳酸铵， B为300 mmol/L碳酸铵;梯度洗脱程序: 0.0~2.0 min， 100% A;2.1 ~5.5 min， 80% A: 5.6-8.6 min， 50% A: 8.7~18.0 min， 0% A: 18. 1 ~20.0 min， 100% A，流速均为0.8 ml/mino
1.2.2 质谱条件
高频等离子体发射功率: 1550 W;载气:氩气(99.999% );载气流量: 0.8 L/ min;载气补偿气流量: 0.4 L/min;氦反应碰撞模式;氨气流量: 4.0 ml/min;采样锥/截取锥;P·锥;采样深度: 8.0 mm;蠕动泵: 0.4r/min。采集质量数:砷75;积分时间: 0.5 s;采集时间: 1200 s。
1.3 样液的制备
称取约0.5g匀浆后的鸡肉样品(准确至0.001 g)于50 mL塑料离心管中，加入20 mlL 10%的甲醇溶液，于组织研磨仪(1 500次/min)中机械振荡5 min，取出后于4 ℃ 12 000 r/min冷冻离心10 min，取10ml上清液置于离心管中，加入10 mL正己烷，振摇1 min后， 8000 r/min离心10 min，弃去上层正己烷。按此过程重复1次，吸取下层清液，经0.45 um有机滤膜过滤后待HPLC-ICP-MS检测。按相同操作方法做空白试验。
2结果与讨论
2.1质谱条件的优化
使用Agilent调谐液(Li、 Y，Co，Ce和TI质量浓度为1 u/L)对仪器进行调谐，以保证仪器的最佳灵敏度和稳定性。砷的电离能较高，难以电离，采用高电离能1550 w以保证各种砷形态化合物能够完全解离，同时优化载气流量、补偿气流量、氨气流量及采样深度等，以提高仪器灵敏度，并使氧物和双电荷的比率符合仪器推荐的要求，优化质谱条件见"1.2.2"所述。
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 色谱柱的选择
采用Agilent SB-Cis和 Hamilton PRP-X100色谱柱均无法同时分离10种砷形态化合物。最终采用Dionex lonPac AS7阴离子色谱柱，在碱性流动相系统下，使得砷以离子状态存在，改善了色谱峰形，获得了良好的分离效果(图1)。
2.2.2 流动相的选择
实验发现磷酸盐体系和甲醇-三氟乙酸体系均不能很好地分离10种砷形态化合物，而高浓度的碳酸铵溶液有利于ROX， NPAA， CBS， As V尽快洗脱。实验最终确定以3.85 mmol/L碳酸铵溶液和300 mmol/L碳酸链溶液作为流动相，采用梯度洗脱的方式可在20 min内实现10种砷形态的良好分离，且峰形尖锐，分离度良好。
2.3 前处理条件的优化
2.3.1 取样量的优化
分别考察了取样量为0.5、1.0、2.0g时10种砷形态化合物的回收率。结果表明，取样量仅对As I的提取有较大影响，取样量越少， As 11的提取回收率越高。当取样量为0.5g时， 10种砷形态化合物的提取率均大于80%，因此，确定本方法的取样量为0.5 g。
2.3.2 提取溶剂的考察
分别考察了5%、10%、25%、50%的甲醇溶液对鸡肉及鸡肝样品中10种砷形态化合物的提取效率。结果表明，当甲醇含量为50%时，高浓度的有机试剂易导致离子源不稳定，甚至熄灭，且有机物分解形成的碳易导致ICP-MS锥口堵塞，噪声提高。当甲醇含量为10%和 25%时均可有效提取样品中的有机肿，且含水比例高可显著提高无机砷(As1和As V)的提取效率。当甲醇含量为5%时，无机砷的提取效率高，但有机肿(如ROX等)不能提取完全。因此，最终选用 10%的甲醇溶液作为提取溶剂，此时， 10种砷形态化合物的提取率均大于80%。
2.3.3 提取及净化方式的考察
分别考察了均质提取、恒温水浴振荡提取以及微波辅助萃取3种提取方式对10种砷形态化合物的提取回收率，结果均不理想(表1)。而采用组织研磨仪高速振荡5min可成功提取10种砷形态化合物，该法省时、简便、高效，且不易造成样品的污染和损失， 10种砷形态化合物的提取率均大于80%。采用甲醇溶液提取、正己烷萃取，可有效去除样品基质中的蛋白质和油脂，所得溶液再经0.45 um有机滤膜过滤去除大颗粒杂质以起到多重净化的作用。
2.4 方法线性范围及检出限
取10种砷的混合标准工作液(1.0 mg/L)用水稀释成0.1、1、5、10，20，50，100 ug/L的混合标谁工作溶液，以质量浓度(x， ug/L)为横坐标，各组分的响应值(y)为纵坐标，在优化条件下进行测定，绘制标准曲线。结果表明， 10种砷形态化合物在0.1-100 ug/L质量浓度范围内线性良好，相关系数(2)均大于0.999，标准曲线回归方程见表2，以HPLC-ICP-MS色谱峰信噪比(S/N)为3时所对应的浓度计算检出限(LOD)，以S/N为10时所对应的浓度计算定量下限(LOQ)，在进样量为25 uL时， 10种砷形态化合物的检出限为0.3-1.5 ug/kg，定量下限为1.0-5.0 ug/kg(以Asi，表2)。
2.5 加标回收率及精密度
选用一系列空白样品，分别添加10种砷的混合标准溶液，使添加水平为1、10，50ug/kg，其余按"1.3"方法操作，分析测定并计算其回收率和精密度，测得3个加标水平下的平均回收率为 81.3%~97.7% ，相对标准偏差(RSD， n=6)为0.1%~3.5%。
2.6 实际样品的检测
按照上述方法对鸡肉和鸡肝等30批次样品进行测定，除1批鸡肝样品检出ASA(3.4 ug/kg)和As "1(2. 7 ug/kg)外，其余样品均呈阴性。表明方法可用于实际样品的测定。
3 结论
本研究建立了HPLC-ICP-MS同时测定鸡肉和鸡肝中ROX， ASA、NPAA，CBS， As V、 As II MMA， DMA，As B和AsC共10种砷形态化合物的分析方法。样品前处理简单，回收率稳定，灵敏度高，适用于鸡肉及鸡肝样品中10种砷形态化合物的定性定量分析，对排查和保证食品安全具有重要的现实意义。