Teledyne ISCO 分析色谱柱在ACCQPrep® HPLC 系统通过一次简单的侦查运行即可生成分离方法。该流程不仅能匹配RediSep® HPLC色谱柱，也匹配RediSep Gold®金标快速色谱柱，这意味着用户可以同时开发闪式快速色谱的方法。来自其他供应商的C18色谱柱也可以用于方法开发，但与RediSep色谱柱相比，选择性可能稍微存在差异，这意味着出峰时间可能不一定会在预期的时间被洗脱。在本应用报告中描述的方法放大流程是有效的，只需将时间转换成柱体积，因为一个化合物在某个特定溶剂组份的洗脱时间是特定的。另一种方法是使用ACCQPrep HP150使用RediSep Prep色谱柱和内置在系统中的聚焦梯度发生器，从侦测运行中快速创建聚焦梯度(参考应用报告AN119)。
实验仪器和色谱柱
实验结果和讨论
对于闪式快速色谱，首选洗脱时间约6个柱体积(CV)，当转换为CV单位时，很容易将uHPLC梯度从一个色谱柱放大到另一个色谱柱。
三段线性梯度效果很好，第一段为12 个CV，目标化合物洗脱在中间，约6个 CV，不管怎样，起始和结束溶剂组成是洗脱化合物所需要的。由于HPLC系统驻留死体积的原因，没有必要在运行开始时等度保持，相对于柱体积和HPLC驻留死体积的大小，运行CombiFlash®NextGen梯度时，目标化合物可能提前或稍微滞后被洗脱。添加一个0.01分钟时长的步骤，然后以100% B清洗色谱柱中清除残留化合物。
每段长度(以分钟为单位)的计算方法是用梯度长度乘以柱体积，然后除以流速。梯度表是通过将分段长度加到前几次的总和而得到的。在表2中，柱体积中的片段长度被转换为时间，并将添加的片段长度形成梯度表。
结果
C8, 2x50 mm 运行实例
在RediSep Prep C8 2 x 50 mm色谱柱上开发的方法，3分钟内，梯度为40% - 50% B，然后一步升到100% B，使用水/乙腈体系清除色谱柱中的杂质。
闪式快速色谱柱的洗脱与uHPLC柱的洗脱非常接近，表明该方法可以通过这种方式转移。
C18, 4.6 x 150 mm 运行实例
在4.6 × 510mm RediSep Prep C18色谱柱上建立了的方法
使用水/乙腈体系，在18分钟内，梯度为50% - 60% B，然后一步升到100% B，以从色谱柱中清洗污染物。C18比C8具有更强的保留能力，因此在柱体积相同的保留时间下，需要更强的溶剂体系才能得到洗脱。
再一次表明，闪式快速色谱柱与分析用高效液相色谱保留有很好的一致性。
值得注意的是，从uHPLC色谱柱转换的方法在闪式快速色谱柱洗脱比预测保留时间稍早，而HPLC预测的洗脱时间比实际闪式快速色谱柱洗脱时间稍早。这是因为在计算中没有考虑系统驻留死体积。
uHPLC和HPLC色谱柱在同一分析仪器上运行，分析系统驻留死体积相对于uHPLC柱更大，但相对于4.6 mm色谱柱较小，因此不同运行时间梯度延迟的程度不同。在分析过程中，最好使目标化合物的洗脱在梯度的中间，以允许不同仪器之间保留体积一定的变化。
结论
RediSep Prep色谱柱可以可靠地用于开发闪式快速色谱的方法，2 × 50mm uHPLC色谱柱是非常快速的方法开发手段，运行基本在5分钟内完成。两种色谱柱都需要极少量的样品，节省几乎所有的待纯化样品。
ACCQ Prep HP150 高压制备型HPLC色谱系统
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流速1-150 mL/min开发分析方法和制备方法
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操作压力可达6000 psi
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UV或UV/VIS基础上选择ELSD和MS检测器
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一键生成聚焦优化梯度
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纯化时间最小化，样本回收率最大化